Diagnostic microbiologic - tehnica PCR

Reactia PCR a fost descoperită în 1983 de către Kary B. Mullis (1993 - Premiul Nobel) şi, după 1988 a cunoscut o dezvoltare explozivă şi o rafinare extraordinară, fiind reacţia care a revoluţionat Biologia Moleculară a Acizilor Nucleici.

Dezvoltarea tehnicii are la bază descoperirea Taq Polimerazei enzima - cheie a reacţiei, o polimerază stabilă la temperaturi înalte (~ 94 °C) la care moleculele de ADN, în mod normal dublu catenare, disociază şi astfel fiecare catena poate fi copiată.

Licenţa de utilizare a reacţiei PCR este deţinută de compania Hoffman La Roche

TEHNICA PCR

Materiale necesare:

ADN de amplificat

Primeri (oligonucleotide, amplimeri)

ADN-polimeraza

dNTP (dezoxiribonucleotid trifosfati)

Soluţie tampon (Mg2+ sau Mn2+, K+)

Termociclul

Etape PCR

Reacţia PCR se desfăşoară în 3 etape:

1. Denaturarea: în urma încălzirii amestecului de reacţie la 94ºC, ADN-ul ţintă este separat (denaturat) in 2 catene;

2. Hibridizarea primerilor: ca urmare a scăderii temperaturii la 55-70ºC, primerii se vor ataşa complementar la capetele 3’ ale celor 2 catene;

3. Elongaţia: la temperatura de 72ºC, ADN polimeraza termostabilă în prezenţa Mn2+ şi a excesului de deoxinucleotid-trifosfaţi (deoxiadenozina, deoxiguanozina, deoxicitidina şi deoxiuridina) va extinde primerii ataşaţi în lungul matriţei ţintă şi va produce un amplicon ADN. Analizorul va repeta automat acest proces pentru un număr stabilit de cicluri (de obicei 30-35), la fiecare ciclu dublându-se cantitatea de amplicon ADN.

DENATURAREA

ADN-ULUI

94-98 ºC, timp de 20-30 de secunde

ADN-ul dublu catenar este desfăşurat în două lanţuri complementare, de care se vor lega apoi primerii

La sfârşitul acestei etape în mediul de reactie vor fi prezente două lanţuri ADN simplu-catenare

CUPLAREA PRIMERILOR

Se scade temperatura la 50-65 ºC, timp de 20-40 de secunde.

Primerii sunt în exces în mediul de reacţie

Lanţ dublu-catenar hibrid – primeri şi ADN de amplificat.