Electroforeză, descoperire și tehnici actuale

1. PRINCIPIUL ANALIZEI [1,2,5,13]

Electroforeza reprezintă o metodă de analiză și separare bazată pe migrarea particulelor solide încărcate electric (ioni, macromolecule cum ar fi ADN-ul și proteinele, coloizi, și unele celule, precum bacterii sau eritrocite) dispersate într-un lichid sub acțiunea unui câmp electric.

Denumirea de electroforeză provine din asocierea cuvântului grec electron (electric) cu cel latin phore (purtător), evidențiindu-se astfel rolul esențial al câmpului electric în procedeul descris.

Mediul în care se pot deplasa speciile încărcate electric pot fi:

-

mediu liber nelegat (pe o coloană de lichid)

-

mediu fixat (pe suport poros)

Prin electroforeză se pot determina mărimea, forma și sarcina unei molecule, masa moleculară, etc.

Electroforeza este folosită și în diagnosticare și în supravegherea terapeutică, prin separarea proteinelor într-un câmp electric. Un exemplu de astfel de test frecvent utilizat pentru diagnostic este electroforeza proteinelor serice. Ea permite dozarea proteinelor în mielom precum și detectarea imunoglobulinei monoclonale. O altă proteină de importanță majoră ce poate fi examinată funcțional prin electroforeză e hemoglobina.

Figura 1: Eletroforeză în gel de agaroză

Electroforeza apare adesea ca o tehnică pregătitoare înainte de clonare, secvențiere ADN, Southern blot, polimorfism de lungime a fragmentului de restricție (RFLP) și analiză prin spectrometrie de masă.

2. SCURT ISTORIC [8,14,15,16,17]

Electrosmoza și electroforeza au fost descoperite de F. F. Reuss la Moscova în 1807. El a folosit două tuburi de sticlă cu fund deschis umplute cu apă pe o țiglă de lut umedă, a depus cu grijă nisip în fundul fiecărui tub și a conectat tuburile la un baterie. Apa de la capătul tubului conectat la polul pozitiv al bateriei a devenit lăptoasă pe măsură ce particulele de argilă au migrat prin nisip.

Hermann von Helmholtz, un medic și fizician german, aduce alte observațiile experimentale folosind o ecuație electroforetică în 1879.

În 1900, William Bate Hardy, un biolog britanic ,a determinat cantitativ mobilitatea proteinelor separate. El a afirmat „Globulinele se dispersează în solvent sub formă de particule, particulele de coloid fiind atât de mari încât formează o fază internă”.

În 1908 Karl Landsteiner a separat proteinele din serul sanguin. El a primit Premiului Nobel pentru Medicină în 1930 pentru descoperirea și clasificarea grupelor sanguine după sistemul ABO (1900).

Theodor Svedberg, un chimist suedez, laureat al Premiului Nobel pentru chimie (1926) și inventatorul ultracentrifugei, și-a încurajat studentul Arne Tiselius să îmbunătățească tehnicile electroforetice ca subiect al tezei sale de doctorat.

După ce a terminat doctoratul în 1930, Tiselius a transformat, în următoarele câteva decenii, electroforeza și aparatul pe care să o efectueze într-un instrument analitic puternic. El a creat o cameră de răcire care a redus aberațiile datorate curenților de convecție în soluția tampon, a încorporat un sistem pentru a vizualiza modelele de migrare a substanțelor incolore folosind refracția diferențială a luminii și a dezvoltat contrafluxul tampon pentru a separa substanțele care, altfel, ar migra în partea de jos a tubul. Tiselius a folosit acest aparat pentru a descrie limitele de mișcare corespunzătoare α-, β- și γ-globulinei din serul sanguin.

Electroforeza se afirmă ca o metodă analitică de separare abia în urma lucrărilor sale (1937). Arne Tiselius a primit Premiul Nobel pentru Chimie în 1948 pentru munca sa.

Figura 2: Arne Tiselius [14]

Oliver Smithies,un genetician britanic-american și biochimist fizician, a introdus amidonul ca suport în 1955. Smithies a dezvoltat tehnica electroforezei pe gel folosind o matrice de amidon, ca o linie secundară a cercetării asupra unei molecule precursoare de insulină, la Universitatea din Toronto. Acest lucru a îmbunătățit capacitatea de a separa proteinele prin electroforeză.