Izolarea și Confirmarea Listeria Monocytogenes

Consecinţa a epidemiilor de listerioză, metodele de izolare si identificare a germenilor din genul Listeria si mai ales specia Listeria monocytogenes au înregistrat un important progres. Timpul necesar pentru detectarea speciei L.monocytogenes s-a scurtat considerabil de la câteva saptamâni la 2-3 zile. Pe lânga metodele bacteriologice s-au dezvoltat metode imunologice (ELISA,ELFA, tehnici de separare magnetica). În paralel cu metodele imunologice s-au dezvoltat si numeroase metode de biologie moleculara (PCR)

1. METODE BACTERIOLOGICE

Majoritatea procedeelor de izolare si îmbogatire selectiva pentru detectarea speciei Listeria monocytogenes se bazeaza pe rezistenta acestei bacterii la anumiti agenti selectivi care inhiba dezvoltarea florei de asociatie.

Agentii selectivi cel mai frecvent utilizati în prepararea mediilor de îmbogatire selectiva includ: acriflavina, acidul nalidixic, clorura de litiu, feniletanolul, moxalactamul si altii

Procedeele de detectare a acestei specii bacteriene în produsele alimentare sau în spatiile de prelucrare a alimentelor, cele mai raspândite sunt cele recomandate de USDA -FSIS (US Departament of Agriculture - Food Safety Inspection Service) pentru detectarea speciei Listeria monocytogenes în carne si produsele din carne si de FDA (Food and Drug Administration), în lapte si produsele lactate.

1.1. PROCEDEUL FDA

Acest procedeu implica o îmbogatire initiala a 25g sau 25ml de proba în 225ml LEB (Listeria enrichment broth). LEB contine TSB la care se adauga 0,6% extract de drojdie, 50mg cicloheximida, 15mg acriflavina si 40mg acid nalidixic /litru.

Probele se incubeaza la 30°C/24-48h, o modificare a procedeului original care cere o îmbogatire de 1-7 zile la 30oC. Urmeaza transplantarea de pe LEB pe mediile: Oxford si LPM (lithium chloride phenylethanol moxalactam), ambele medii înlocuiesc agarul Mc Bride modificat (MMA), recomandat initial ca mediu selectiv de izolare. Mediile se incubeaza la 35°C/48h apoi coloniile trebuie confirmate ca apartin speciei Listeria monocytogenes. Testele de confirmare includ examinarea coloniilor alb-bleo în lumina oblica la 45o, mobilitatea, catalaza, hemoliza pe agarul cu sânge, testul CAMP, rosu-metil, Voges Proskauer, fermentarea manitolului, xilozei si ramnozei

Procedeul FDA a fost conceput, în mod special pentru optimizarea izolarii speciei Listeria monocytogenes în lapte si produsele lactate.

1.2.PROCEDEUL USDA- FSI

Procedeul de îmbogatire selectiva USDA-FSIS pentru izolarea speciei Listeria monocytogenes din carne, a fost dezvoltat de Mc Clain and Lee. Ulterior, acest procedeu a fost utilizat cu succes si pentru produsele lactate si probele de mediu.

De asemenea, acest protocol include o îmbogatire initala a 25ml sau 25g proba în 225ml mediu LEB 1, care înlocuieste bulionul initial de îmbogatire UVM (University of Vermont Medium).

Bulionul de îmbogatire primara LEB 1 contine pe litru: 5g proteoza- peptona, 5g triptona, 5g Leb Lemco, 5g extract de drojdie, 20g clorura de sodiu, 12g fosfat disodic - 7- hidratat, 1,35 fosfat monobazic de potasiu, 1g esculina, 20g acid nalidixic, 1,2mg acriflavina.

Urmeaza incubarea la 30°C/20-24h. Apoi 0,1ml mediu de îmbogatire primara se transfera în 10ml bulion de îmbogatire secundara Fraser si se incubeaza la 35oC/ 24h si 40h.

Bulionul de îmbogatire secundara Fraser, contine pe litru: 52g UVM, 3g clorura de litiu, 25mg acriflavina si 0,5g citrat feric de amoniu.

Se incubeaza la 35°C/24-48h, dupa care probele se trec pe agar Oxford modificat(MOX), care se incubeaza la 35°C/24h si se examineaza coloniile tipice de Listeria. Hidroliza esculinei si reactia ulterioara cu citratul feric de amoniu, determina producerea unui precipitat negru în jurul coloniilor de Listeria pe agarul MOX. Coloniile tipice sunt transplantate pe agar cu 5% sânge de cal. Coloniile transparente, betahemolitice sunt transplantate în bulion BHI, care se incubeaza peste noapte la 35oC si se efectueaza testele de confirmare prezentate la procedeul FDA.