Testul imunoenzimatic Elissa

- Capitolul 1

1.Testul imunoenzimatic Elisa pentru diagnosticul pestei

porcine clasice

1.1 Scopul

Stabilirea regulilor şi responsabilitatea privind diagnosticul serologic al bolii pesta porcină clasică

1.2 Principiul metodei

Testul este varianta Elisa de blocare ce foloseşte microplăci căptuşite cu antigene CSFV. Anticorpii prezenţi în proba de testat vor bloca legarea conjugatului antiCSFV la antigene. Conjugatul antiCSFV conţine anticorpi monoclonali cuplaţi cu peroxidază care în urma acţunii asupra unui substrat va dezvolta o reacţie de culoare. Dezvoltarea culorii este maximă (rezultat negativ) în absenţa anticorpilor specifici. Procentul de blocare al probei este calculat în urma diferenţei dintre DO450 probei şi DO450 a serului de control negativ.

Metoda este utilizată pentru detecţia anticorpilor anti virusul pestei porcine clasice, în populaţiile în care nu se practică vaccinarea antipestoasă.

1.3 Reagenţi

- plăci 96 godeuri/stripuri căptuşite cu Mab; soluţie de spălare (x10); ser de control negativ;ser de control pozitiv; diluant probe; conjugat Mab cu peroxidază; soluţie substrat TMP; soluţie stopare

1.4 Echipamente de încercare şi mijloace de măsurare

1.4.1 Aparatura:

- combină frigorifică Angelantoni; centrifugă Hettich; cititor densităţi optice Sunrise Tecane; micropipetă Labsystems multicanal; micropipetă Transferpette multicanal (30-300); micropipetă multicanal Labsystems; micropipetă Boeco multicanal (5-100µl); micropipetă monocanal Transferpette (10-100); micropipetă Mettler Toledo (10-100); termohigrometru Ebro

1.4.2 Instrumentar:

- ochelari de protecţie; micronixuri; tăviţe pentru reagenţi; camera umedă (cuva din plastic); vârf de unică folosinţă

1.4.3 Alte materiale

- lavete care nu lasă scame; pungi de plastic; saci; mănusi de protecţie; halat; lavete; bonete; container Biorad; folii de acoperire a plăcilor Elisa; dezinfectant de laborator; hârtie de filtru; marker water proof

1.4.4 Sticlărie

- eprubete; pipete 2 ml sau 10 ml; cilindrii gradaţi cu capacitate de 100 ml şi 100 ml

5. Modul de lucru

5.1 Pregătirea/conservarea probelor

După recepţionare, probele de sânge care nu au exprimat ser se vor lăsa 1-2 ore la temperatura camerei. După examinarea serului, acesta se va transvaza în micronixuri (câte 100-500 µl/recipient). În cazul în care nu s-au recepţionat suficiente probe pentru ocuparea unei microplăci, acestea se vor stoca la -20°C după o identificare corespunzătoare.

Probele nu vor suferi mai mult de un proces de îngheţ-dezgheţ. Înainte de testare probele se aduc la temperatura camerei. Cantităţile suficiente din proba originală se păstrează la congelator pentru eventuala refacere a testului imunoenzimatic, reprezintă contraprobe. Probele au rezultat pozitiv şi se pastrează timp de 60 de zile la -20C şi se înregistrează în fişele de contraprobe.

5.2. Efectuarea propriu-zisă a testului imunoenzimatic

- Se marchează poziţia probelor pe fişa de lucru. Se calculează necesarul de godeuri în funcţie de numărul serurilor care trebuie examinate şi se notează în fişa de lucru.

- Dacă probele au fost stocate la congelat, acestea se vor decongela la temperatura camerei cu 2 ore înainte de introducerea în placă.

- Toţi reagenţii din trusa Elisa se aduc la temperatura camerei de 18-26°C (se scoate trusa din frigider cu 60 min înainte de a începe testarea).

- Plăcile de microtitrare, diluantul pentru probe, serurile de control, conjugatul, soluţia substrat şi soluţia de stopare sunt gata de utilizare

- Tamponul de spălare concentrat se diluează 1:10 cu apa demineralizată sau distilată. Dacă soluţia concentrată conţine cristale, acestea trebuie lăsate în apă caldă cel puţin 30min.

- Se scoate microplaca din pungile vidate folosindu-se un număr de stripuri (godeuri) corespunzător numărului de probe.

- Se repartizează cu micropipeta 50 µl diluant probe în toate godeurile pentru controale şi probe.