Markeri Moleculari ADN și Utilitatea Acestora

MASTER I

Principala utilitate a markerilor moleculari este este reprezentata de folosirea acestora in diferitele tehnici de diagnostic sau de terapie se creste specificitatea si acuratetea rezultatelor obtinute ducand la obtinerea unor date cat mai sigure si reale. Acesti markeri AND ce au cunoscut o dezvoltare exponentiala incepaind cu descoperirea tehnicii PCR au fost dealungul timpului modifiacti si inbunatati continuu, astfel ca s-a ajuns ca in present sa existe o multitudine de tipuri de markeri AND, toti avand la baza tehnica de polimerizare in lant.

In genere un marker ADN are la baya o secventa de ADN localizata oriunde pe cromozomii genomului, cu conditia ca regiunea pe care se gaseste sa prezinte o variatie detectabila care sa faca posibila diferentierea intre doi sau mai multi indivizi inruditi. Markerii moleculari de tip ADN sunt metode ce is gasesc utilitatea in mai multe domenii ce tin de stiintele biologice, cele mai des intalnite fiind ingineria genetica, biologia moleculara sau biotehnologia. Pentru alegerea markerilor ce se potrivesc intr-un anumit experiment se face in primul rand tinand cont de scopul urmarit dar si de acuratetea datelor ce se doresc a fi inregistrate dupa experimentul respectiv, de aceea alegerea markerilor respectivi reprezinta o etapa desoebit de importanta ce necesita cunostinte solide din partea analistului.

Plaja de utilizare si aplicare a markerilor moleculari este destul de larga, dar cele mai multe studii se fac pentru ameliorarea speciilor (selectie asistata de markeri), cartarea si clonarea genelor individuale , caracterizarea trasaturilor cantitative si examinarea si analiza diversificarii genetice, markerii moleculari permitand o localizare genetica precisa a factorilor erteditari (QTL ce codifica pentru carcaterele de interes).

Materiale si metode

Datorita faptului ca elementele constituente ale componentelor celulare difera, procesul de izolare a ADN se desfasoara în mai multe etape, acestea putând fi modificate în functie de materialul biologic.

Pentru acest experiment a fost folosit material biologic vegetal, si anume frunze de grâu recoltate într-un stadiu timpuriu al cresterii. În acest experiment procesul de izolare a ADN s-a realizat dupa o metoda dezvoltata de Saghai-Maroof si colab. (1984).

Prima etapa a izolarii ADN este reprezentata de distrugerea învelisului celular, care se poate realiza folosind mai multe tipuri de metode:

- Metode fizice: - soc termic

- ultrasunete

- mojarare - cu nisip de cuart

- cu bilute de sticla

- cu azot lichid

- Metode enzimatice: cu lizozim

În cazul acestui experiment maruntirea si distrugerea peretelui celular s-a realizat prin mojarare cu azot lichid. Ulterior se realizeaza liza celulara, care consta în ruperea membranei plasmatice si eliberarea continutului celular. Aceasta se realizeaza folosind un tampon de liza cu pH alcalin (8>pH alcalin<12), care poate fi unul dintre detergentii: sodium dodecil sulfat (SDS), cetil trimetil amonium bromide (CTAB), deoxicolat de sodiu.

Liza celulara s-a realizat folosind un tampon de liza pe baza de CTAB; mai mult, pentru cresterea eficientei lizei celulare, tamponul se încalzeste la 65°C înainte de folosire, iar proba se tine pe baie de apa (65°C) timp de 1-1,5h, omogenizându-se din când în când.

Urmeaza etapa în care se realizeaza deproteinizarea, folosind una din substantele:

- proteinaza K;

- cloroform/alcool izoamilic 24:1;

- fenol/cloroform/alcool izoamolic.

În acest experiment deproteinizarea s-a realizat cu amestec cloroform/alcool izoamilic. Dupa adaugarea amestecului deproteinizant, probele se omogenizeaza usor, astfel încât tot materialul vegetal sa intre în contact cu amestecul.

În urma tratarii cu acest amestec probele se centrifugheaza, rezultând ulterior trei faze separate:

- faza apoasa (în partea superioara), care contine macromoleculele de ADN;

- inelul proteic (între faza apoasa si faza organica);

- faza organica (în partea inferioara a eprubetei) reprezentata de amestecul deproteinizant.

În urma acestei operatii vor fi îndepartate o parte din proteine si resturile celulare.

Se reia faza apoasa si se repeta tratamentul cu cloroform/alcool izoamilic, pentru îndepartarea proteinelor ramase.