Proiect papaină

Hidrolazele sunt cea de-a treia clasă de enzime, ele fiind enzime ce catalizează scindarea diferitelor legături covalente din molecula substratului cu participarea moleculelor de apă.Această clasă conține aproximativ 24% din enzimele cunoscute până in prezent.

Reacția generală: 

S – R + H2O S – OH + R – H

Reacțiile hidrolitice se întâlnesc în aproape toate căile metabolice, hidrolazele participând atât la metabolismul glucidelor, lipidelor, proteinelor cât și în metabolismul produșilor secundari.

Clasificarea hidrolazelor in subclase si subsubclase se face in funție de natura legăturilor chimice ce urmează a fi scindată.

Din această clasă fac parte enzimele proteolitice O enzimă proteolitică de origine vegetală este si papaina.

Papaina are codul E.C. 3.4.22.2, și este sintetizată de o plantă din zonele tropicale – Carica Papaya.

Cantitătile cele mai mari de papaină se găsesc in fructele de papaya, înainte de coacere. Pentru obținerea industrială a papainei pure se recoltează latex-ul care se depozitează la rece (+4˚C). Pentru inlăturarea impurităților se dilueaza cu apa distilată, se agită și se centrifughează sau se filtrează pe Kiesselguhr, după care se liofilizează sub vid la 50˚C. Se obține o pudră de culoare albă care însă se oxidează relativ ușor devenind brună datorită prezenței grupelor – SH libere.

Papaina înalt purificată a fost cristalizată prima dată in 1937 de către de Balls, T. et al. Ea este o enzimă tiolică ce conține 211 resturi de aminoacizi și are o masă moleculară de 23 kDa. Structura are dimensiunile 5 x 3,7 x 3,7 nm şi poate fi considerată ca o proteină ,,binucleară” fiind alcătuită din doi centri hidrofobi.

Temperatura optimă de acțiune se situează între 55˚ – 65˚C, enzima având o termostabilitate crescută (denaturarea termică se observă abia la 65˚ - 70˚C), iar pH-ul optim se înscrie în domeniul de pH 5,0 – 7,0 ceea ce facilitează utilizarea sa în diferite procese tehnologice.

Fiind o proteinază tiolică, papaina este puternic inhibată de reactivii tiolici și, foarte interesant, este activată de către 2 – mercaptoetanol. Este o enzimă foarte rezistentă la acțiunea denaturată a solvenților organici. Specificitatea de acțiune a papainei este relativ largă, ea recunoscând nu mai puțin de 7 aminoacizi. Scindează însă preferențial legăturile peptidice realizate de resturile de fenilalanină din interiorul catenelor polipeptidice, fiind o endopeptidază

Papaina este solubilă în apă la 10 mg/ml. Imediat înainte de utilizare enzima este deobicei diluată în tampon care conține ~5mM L-cisteină. Printre agenții de activare/stabilizare se numără EDTA, cisteina, dimercaptopropanol.

Deși soluțiile papainei au o stabilitate bună la temperatură, stabilitatea soluției este dependentă de pH. Soluțiile papainei sunt instabile în condiții acide, de exemplu, la valori ale pH-ului mai mici de 2,8 există o pierdere semnificativă a activității. Pentru enzima activă în soluție, pierderea în activitate este de aproximativ 1-2% pe zi, probabil ca rezultat al autolizei și/sau oxidării.

O formă comună de papaină inactivă obținută în timpul izolării este un amestec de disulfide format din partea activă a grupului sulfhidric și cisteina liberă.

Soluțiile papainei sunt stabile la mai mulți agenți de denaturare, de exemplu, o activitatea toatală este menținută după recristalizarea în 70% metanol și în 8 M solutii de uree. Cu toate acestea, există o pierdere semnificativă în activitate atunci când papaina este expusă la acid tricloracetic 10% sau la 6 M clorhidrat de guanidină.