Aplicații ale enzimelor din clasa dehidrogenazelor în dezvoltarea de biosenzori și noi metode analitice pentru controlul rapid al calității produselor agroalimentare

I. STUDIUL PRINCIPALILOR PARAMETRII DE CALITATE AI PRODUSELOR AGROALIMENTARE

Creşterea continuă a interesului pentru toate aspectele implicate în procesul de reglementare a calităţii produselor si serviciilor a determinat, implicit, introducerea obligativităţii pentru producători/prestatori de servicii, agenţi comerciali, de respectare a normelor stricte privitoare la controlul calităţii si siguranţei de folosire şi, drept consecinţă, la creşterea interesului (atât al acestora cât al organismelor de control abilitate) în dezvoltarea de noi instrumente de control, fiabile şi uşor de utilizat.

În această idee, in prezentul grant, s-au realizat şi optimizat biosenzori pentru determinarea unor compuşi utilizati ca indicatori de calitate ai vinurilor,.

Obiectivele prevăzute a se îndeplini au avut ca finalitate obţinerea informaţiilor analitice fiabile, din punct de vedere al parametrilor operaţionali, care să permită elaborarea modelului experimental pentru instrumentul de analiză reprezentat de către biosenzorul enzimatic ce stă la baza realizării ulterioare a unui prototip pentru sistemul de detecţie al unor compusi organici de interes din vinuri, nivelul de concentraţie al acestora fiind un indice al calităţii acestui produs.

Pe plan internaţional, organizaţia abilitata pentru elaborarea standardelor referitoare la metodele de analiza a vinurilor este “Office Internaţional de la Vigne et du Vin” ( O.I.V ) cu sediul la Paris. Ansamblul metodelor de analiza dezvoltate de O.I.V şi publicate în ‘’Recueil des methodes internationales d´analyse des vins et des mouts” au fost recunoscute ca metode oficiale, obligatorii în Uniunea Europeana prin Regulamentul CEE nr. 1972/87.

Etapele parcurse în elaborarea modelului experimental pentru realizarea biosenzorului/ instrumentului de măsură sunt prezentate în schema de mai jos (figura 1). Trebuie subliniat că etapa de calibrare si aplicare a senzorului construit este inerentă elaborării modelului experimental şi reprezintă punctul cheie în dezvoltarea ulterioara a instrumentului de detecţie realizat, de la aceste prime date pornindu-se în stabilirea indicatorilor fizici caracteristici prototipului.

Figura 1. Schema de realizare a modelului experimental pentru biosenzori

In România, în prezent, se are in vedere armonizarea legislaţiei naţionale cu cea europeana, în vederea integrării în Uniunea Europeana. Din acest motiv dar si pentru a facilita exportul vinurilor româneşti si pentru a permite monitorizarea cât mai completa a procesului de vinificaţie exista un mare interes în modernizarea standardelor de metode de analiza a vinurilor prin introducerea de metode noi de analiza, specifice, bazate pe enzime.

Realităţile economice din tara noastră si preturile destul de ridicate ale enzimelor ca reactivi analitici impun însă explorarea dezvoltării de metode cu caracteristici asemănătoare metodelor O.I.V dar care sa implice costuri mult mai mici.

Pe plan naţional, metodele standardizate de analiza a compuşilor organici din vinuri sunt nespecifice, laborioase si presupun utilizarea de echipamente performante, costisitoare, fiind în plus metode destul de vechi.

Utilizarea dehidrogenazelor ca elemente biocatalitice în realizarea de senzori enzimatici se datorează avantajelor pe care le oferă aceste enzime în comparaţie cu oxidazele şi peroxidazele. Dintre aceste avantaje, mai importante sunt:

- independenţa faţă de prezenţa oxigenului;

- determinările amperometrice se realizează la valori mici de potenţial, fapt ce conduce la îmbunătăţirea selectivităţii;

- specificitate crescută faţă de anumite substraturi de interes analitic.

În funcţie de natura cofactorului enzimatic, dehidrogenazele pot fi clasificate în trei grupe:

- enzime dependente de nicotin adenin dinucleotid (NAD+) sau nicotin adenin dinucleotid fosfat (NADP+);

- flavoenzime, care au drept cofactor enzimatic flavin adenin dinucleotidul (FAD) sau flavin mononucleotidul (FMN);

- chinoproteine, care au drept cofactor enzimatic pirolchinolinchinonă (PQQ).

Ca urmare a selectivităţii îmbunătăţite, dehidrogenazele sunt preferate în multe aplicaţii, în special la analiza produselor alimentare şi a băuturilor alcoolice (ex.: determinarea acizilor L- şi D-lactic, acizilor L- şi D-malic, alcoolului etilic, acetaldehidei, glutamatului, glucozei, fructozei, glicerolului, anhidridei sulfuroase etc) [1-50]. În prezent, o serie de metode enzimatice standardizate au la bază dehidrogenaze NAD+-dependente. Numărul aplicaţiilor care au condus efectiv la realizarea de biosenzori comerciali reprezintă o proporţie infimă faţă de numărul rapoartelor de cercetare, în primul rând datorită stabilităţii nesatisfăcătoare a receptorului biologic şi interferenţelor complexe cauzate de compuşii prezenţi în probele reale [51]. Eforturile actuale în domeniu se concentrează pe identificarea soluţiilor optime de ameliorare a stabilităţii senzorilor, reducerea costului unei determinări şi eliminarea problemelor legate de trecerea la producţia de serie.

Majoritatea biosenzorilor bazaţi pe dehidrogenaze prezentaţi în literatura de specialitate sunt biosenzori enzimatici amperometrici pentru care mărimea semnalului electric înregistrat este direct proporţională cu concentraţia speciei de determinat.

Prin elaborarea şi dezvoltarea unor metode de măsurare adecvate studiului fenomenelor caracteristice procesului de fermentaţie malolactica si urmăririi evoluţiei în timp a calităţii vinului se urmăreşte atingerea următoarelor obiective:

[1] creşterea nivelului tehnic şi calitativ în determinările cantitative ale acizilor L—lactic şi L-malic;

[2] aplicarea / respectarea standardelor europene în determinările cantitative ale acizilor L—lactic şi L-malic;

[3] creşterea gradului de acurateţe şi precizie, la costuri mici, a determinărilor specifice analizelor de vin ca urmare a creşterii selectivităţii, sensibilităţii biosenzorilor enzimatici,

[4] creşterea eficienţei şi calităţii serviciilor laboratoarelor specializate în determinări şi analize de vin;

[5] dezvoltarea (şi implementarea la producătorii de vinuri) de sisteme de monitorizare on-line a acizilor L-lactic şi L-malic ;

[6] siguranţă alimentară prin obţinerea unor vinuri de calitate superioară;

[7] creşterea gradului de automatizare a proceselor de măsurare, încercare si control prin utilizarea tehnicilor asistate de calculator.

Biosenzorii enzimatici şi sistemele integrate de monitorizare cât şi metodele dezvoltate în cadrul acestui gt de cercetare au caracter inovator cu efecte pozitive în crearea cadrului adecvat necesar asigurării comparabilităţii măsurătorilor si încercărilor, esenţiala pentru funcţionarea efectiva a pieţei unice si pentru a demonstra conformitatea cu legislaţia europeană în domeniul calităţii vinurilor.

In mod concret pentru atingerea obiectivelor propuse au fost utilizate sisteme monoenzimatice de analiza, mai simple si mai ieftine comparativ cu metodele O.I.V, care sunt bazate pe cuplarea a doua sau trei reacţii enzimatice.

În cadrul acestui proiect enzimele au fost utilizate într-o prima etapa sub forma libera. In scopul scăderii si mai importante a preţului / analiza, enzimele au fost imobilizate utilizând tehnici specifice de imobilizare.