Obținerea unor enzime pe cale microbiană

1. INTRODUCERE

În momentul de faţă industria biotehnologică modernă furnizează o gamă largă de produse cu aplicabilitate în producţiile animale. Locul pe care îl ocupă acestea în nutriţia animală şi scopul lor ca ingrediente furajere care îmbunătăţesc starea de sănătate şi performanţele economice ale animalelor este recunoscut şi aprobat. Dovada acestui fapt este larga lor utilizare şi mai ales încorporarea lor în raţiile folosite de marile întreprinderi de creştere a animalelor. O pondere mare în rândul produselor biotehnologice furajere o reprezintă enzimele furajere. Toate datele de literatură indică folosirea enzimelor de origine microbiană în alimentaţia animalelor datorită multiplelor avantaje (preţ scăzut, disponibilitate indiferent de sezon, biosecuritate, etc)

Cercetările noastre în cadrul acestui proiect de cercetare s-au axat pe ameliorarea capacităţii microorganismelor de a produce enzime amilolitice şi proteolitice de uz furajer. În prima tranşă de finanţare (anul 2003)a fost însuşită metodologia de transformare genetică directă, utilizând ca vector de transfer a genei pentru a-amilază, ADN-ul total extras din microorganismul folosit ca donor. În continuare au fost puse la punct tehnicile de selecţie, izolare şi păstrarea a microorganismelor în conserv vegetativ. În tranşa a doua de finanţare (anul 2004) s-au realizat următoarele activităţi: 1. determinarea stabilităţii în timp a genomului nou format prin inserţia genei a-amilazei; 2. transformarea genetică în prezenţă de cationi bivalenţi a unei tulpini de Bacillus liqueniformis cu ADN plasmidial, 3. transformarea genetică prin electroporare a unei tulpini producătoare de proteaze; 4. transformarea genetică de protoplaşti a unei tulpini de Bacillus liqueniformis cu ADN plasmidial, 5. testarea capacităţii de biosinteză a tulpinilor nou create.

2. DATE DE LITERATURĂ

2.1. Biosinteza a-amilazelor bacteriene

a-Amilazele bacteriene hidrolizează parţial amidonul, păstrând configuraţia a a atomului anomeric de carbon în produşii de reacţie. Fragmentele de amidon rezultate în urma hidrolizei sunt dextrinele. Operaţia de hidroliză cu α-amilaze se numeşte dextrinizare. În industrie, această operaţie se mai numeşte fluidificare, datorită scăderii vâscozităţii suspensiei de amidon, la sfârşitul operaţiei.

Microorganisme producătoare de a-amilaze

În general a-amilazele bacteriene sunt enzime termostabile. Cei mai importanţi producători de a-amilază bacteriană sunt speciile din genul Bacillus şi anume B. subtilis şi B. amyloliquefaciens. Aceste tulpini produc a-amilaze cu proprietăţi similare dar cu reacţii imunologice diferite. Primele preparate comerciale apărute pe piaţă conţineau enzime bacteriene produse de aceste specii. Mai târziu au apărut preparate enzimatice conţinând enzime cu înaltă termostabilitate produse de speciile B. licheniformis şi B. stearothermophilus.

Diferenţa dintre a-amilazele produse de B. amyloliquefaciens şi cele produse de B. licheniformis constă în compoziţia diferită a hidrolizatului de amidon obţinut cu aceste enzime. Astfel, primul conţine drept component major maltohexoze, iar în al doilea caz se obţin preponderent maltopentoze şi maltoză.

În mod asemănător, în funcţie de specia bacteriană utilizată în procesul de biosinteză, compoziţia în oligoglucide a produsului de reacţie este diferită, deşi per global, gradul de hidroliză calculat prin determinarea cantităţii de glucide reducătoare obţinute în urma hidrolizei enzimatice, raportate la cantitatea totală de substrat (amidon) utilizat este aproximativ acelaşi (20-25%).

2.2. Biosinteza a-amilazelor cu tulpini modificate genetic

Obţinerea a-amilazelor cu tulpini modificate genetic a constituit subiectul unor studii intense efectuate pe parcursul ultimilor 20 de ani. Primele studii cu tulpini hibridizate au fost recenzate de Ingle şi Erickson în 1978.

Identificarea genei amyE şi a altor câteva gene reglatoare implicate în producere a-amilazelor, a fost realizată în 1979 la B. subtilis.

Namura şi colaboratorii (1979) au obţinut prin transducţie un fag conţinând gena a-amilazei din Bacillus subtilis. În acelaşi timp Yoneda şi colab. (1979) au utilizat un fag pentru a transfera gena răspunzătoare de producerea a-amilazei de la B. amyloliqefaciens la o mutantă amilaz-negativă de B. subtilis. După această perioadă studiile genetice la tulpinile de B. subtilis au continuat cu mai multă intensitate deoarece acestea aveau o importanţă comercială deosebită. Ca urmare s-a demonstrat efectul sinergic a cel puţin şase gene diferite implicate în mutaţii. Hitotsuyamagi şi colab. au obţinut în anul 1979 o tulpină care produce de 1500 de ori mai multă a-amilază, decât tulpina parentală.