Enzimologie

Curs 1

EXTRACŢIA ENZIMELOR

Este evident că pentru a putea înţelege în detaliu comportarea unei enzime într-un sistem complex în care există ea în mod obişnuit - aşa cum sunt organitele celulare (mitocondrii, lizozomi, ribozomi etc.), celula, tesuturi, organe parti sau întregul organism – este necesar să încercăm în primul rând să-i înţelegem proprietăţile în cel mai simplu sistem posibil. În cele mai multe cazuri, când enzima este exocelulară, sistemul simplu este constituit dintr-o soluţie enzimatică care conţine şi mici cantităţi de ioni, molecule tampon, cofactori, etc. În alte cazuri, însă, cum sunt cele în care enzimele sunt componente a unor organite celulare sau sunt legate de membranele celulare izolarea enzimei este un proces mai complicat deoarece enzima poate fi inactivată dacă în mediu nu există unii componenţi adiţionali specifici.

Strategia de alegere a sursei enzimatice

Pentru studierea proprietatilor structurale sau/si biochimice ale unei enzime trebuie aleasa sursa care raspunde cel mai bine cerintelor de izolare cu o activitate catalitică maximă adică enzima prezentă sa nu fie degradată sau inactivată şi să fie de puritate maximă posibilă adică nu trebuie să conţină alte enzime sau molecule mari. Daca se urmareste si purificarea enzimei, scopul purificarii trebuie sa fie obtinerea unui preparat cu un randament maxim posibil rezultat din procentul de activitate recuperată comparativ cu activitatea extractului original.

Strategia de alegere a unui material biologic pentru extragerea unei enzime utilizabile in diferite scopuri sau pentru studiul ei este necesar să se ţină cont de o serie de factori cum sunt:

- abundenţa enzime;

- disponibilitatea şi preţul de cost;

- localizarea intracelulara;

- caracterizarea sursei;

- studii comparative.

In toate etapele de alegere a sursei trebuie sa se aibe in vedere si stabilitatea enzimei si posibilele dificultăţi în manipularea sursei.

Abundenţa enzimei. Deoarece pentru orice studiu, experimentare, este necesar să se obţină extracte proteice totale cu concentraţii ridicate ale enzimei de interes trebuie alese surse biologice bogate în enzima dorită.

Astfel rădăcinile de hrean sunt surse extrem de bogate de peroxidaze, muşchiul inimiii este bogat în lactatdehidrogenaze, glandele mamare în periada lactaţiei sunt o sursă bună de acetil CoA carboxilază şi rinichii sunt bogaţi în hidrolaze.

Microorganismele sunt surse de obţinere prin procese biotehnologice a enzimelor utilizate în diverse domenii cum sunt agricultura, industria alimentară, industria farmaceutică, pielărie etc. De exemplu un microorganism cunoscut de toată lumea, drojdia de bere (Saccharomyces cerevisiae), care este utilizată în special în panificaţie şi industria berii, se obţine uşor în cantităţi mari şi este foarte bogată în enzime glicolitice. Avantajul utilizării microorganismelor ca surse de enzime constă în faptul că prin modificări ale mediului de cultură sau modificări genetice se poate creşte nivelul de producţie a enzimei de interes.

Astfel sinteza -D-galactozidazei poate fi indusă la E. coli prin creşterea bacteriei într-un mediu care conţine lactoză (substratul enzimei) ca unică sursă de carbon. Dezvoltarea tehnicilor de clonare moleculară, a ADN-ului recombinant, a determinat apariţia unor noi metode de realizare a unor tulpini de microorganisme înalt producătoare de enzime. În această tehnică, gena care codifică o enzimă este izolată de la organismul parental şi expresată la un nivel ridicat într-un organism de creştere convenabil cum sunt E. coli şi drojdiile. Prin această tehnică o tulpină de E. coli a produs de 100 până la 200 de ori mai multă glutation reductază decât tulpina sălbatică.

Trebuie să subliniem că deşi aceste tehnici reprezintă posibilităţi reale de creştere a capacităţii de biosinteză a unei enzime pot apărea probleme considerabile la exprimarea unor gene eucariote în celule procariote, astfel încât, în unele cazuri proteinele supra exprimate pot forma agregate insolubile şi recuperarea activităţii enzimatice din acestea nu a fost totdeauna posibilă.