Caracterizarea cinetică a polifenoloxidazelor din struguri

OBIECTIVELE CERCETĂRII

Evidenţierea, pe baza celor mai noi informaţii documentare, a beneficiilor pentru sănătatea omului oferite de consumul de struguri

Documentarea caracteristicilor structurale, fizico-chimice şi cinetice ale polifenoloxidazei din struguri, care să permită o corectă abordare a cercetărilor aplicative, inclusiv alegerea unor inhibitori ieftini şi eficienţi

Stabilirea comportamentului polifenoloxidazei din struguri pe diferite substraturi, în diferite sisteme de lucru

Determinarea conţinutului de polifenoli totali şi a activităţii reducătoare a sucului de struguri

Purificarea preparatului de polifenoloxidază şi caracterizarea cinetică

Testarea efectului inhibitor al acidului ascorbic faţă de îmbrunarea enzimatică a sucului de struguri.

MATERIALE ŞI ECHIPAMENTE

Struguri de masă, soi necunoscut

Substraturi:

-Catechol 5 si 10 mM;

-Guaiacol 5 si 10 mM;

-L-tirozina 5 si 10 mM;

-L-DOPA 5 si 10 mM;

Reactiv Folin Ciocalteu; Solutie saturata de carbonat de sodiu

Tampon fosfat de sodiu 200 mM (pH = 6,6);

Fericianura de potasiu, 1%; Acid tricloracetic, 10%;

Clorura ferica, 0,1%; Carbonat de sodiu 2%;

Hidroxid de sodiu 0,1 N; Sulfat de cupru;

Tartrat dublu de natriu şi potasiu 1%;

SDS (dodecilsulfat de sodiu 0,1%);

Apa distilata; Vata si hartie de filtru

Balanta analitică, Sartorius;

Storcător de fructe, Philips;

Blender de bucatarie Philips;

Centrifugă Hettich;

Centrifuga Janetzky,cu răcire;

Spectrofotometru HACH DR 3000.

METODE

Obţinerea preparatului brut de polifenoloxidaza din struguri

Obţinerea sucului de primă presă (P1)

Strugurii s-au stors într-un storcător casnic. Randamentul în suc a fost de 53%, 34% a reprezentat pulpa epuizată şi 13% au fost pierderi. Sucul obţinut s-a filtrat prin vată şi apoi s-a centrifugat la 3000 rot/min, timp de 10 min, pentru îndepărtarea particulelor în suspensie. După centrifugare, s-a efectuat o diluţie de 1:5 a sucului cu apă distilată, iar sucul diluat şi filtrat prin hârtie de filtru s-a supus determinărilor propriu-zise.

Obţinerea sucului după a doua presare (P2)

100g pulpă de struguri epuizată, rezultată de la obţinerea sucului P1, s-au amestecat cu 200 ml apă potabilă, s-au omogenizat cu blenderul 2 min şi s-au centrifugat la 3200 rot/min, timp de 20 minute, la temperatura de 4˚C. Acest suc, numit P2, s-a diluat 1:5 cu apă distilată şi s-a filtrat prin hârtie de filtru.

Determinarea activităţii polifenoloxidazei

Determinarea activităţii PFO s-a efectuat prin urmărirea coloraţiei dezvoltată în urma acţiunii enzimei asupra substratului, în decurs de 30 de minute, la temperatura camerei, ca extincţie la 470 nm. Pentru a observa şi interferenţa altor oxidaze, s-a efectuat, în paralel, citirea extincţiei amestecului de reacţie la 410 nm.

Determinarea compuşilor polifenolici totali conform metodei Shahidi şi Naczk (1995):

0,25 ml suc diluat şi filtrat s-au amestecat cu 0,25 ml reactiv Folin-Ciocâlteu (diluat cu apă 1:1, v/v), 0,5 ml soluţie saturată de Na2CO3 şi 4 ml apă distilată. Amestecul s-a menţinut la temperatura camerei, 25 minute, s-a centrifugat 10 minute la 5000 rot/min iar supernatantului i s-a citit absorbanţa la 725 nm.

Cuantificarea polifenolilor totali s-a realizat cu ajutorul unei curbe etalon trasate cu acid galic (mg ac. galic/100g struguri).

Proba martor s-a lucrat la fel, cu deosebirea că s-au folosit 0,25 ml apă distilată în loc de soluţie extract (suc de struguri diluat şi filtrat).

Determinarea puterii reducătoare prin metoda Oyaizu:

2,5 ml extract s-au combinat cu 2,5 ml tampon fosfat de sodiu 200 mM (pH=6,6) şi 2,5 ml de fericianură de potasiu 1%. Amestecul s-a incubat la 50C, 20 minute. După adăugarea a 2,5 ml acid tricloracetic (TCA) 10%, amestecul s-a centrifugat la 2000 rot/min, 10 minute. 5 ml din supernatant s-au amestecat cu 5 ml apă distilată şi 1 ml clorură ferică 0,1% iar absorbanţa amestecului s-a citit la 700 nm, faţă de un martor realizat cu 2,5 ml apă distilată în loc de suc . O absorbanţă crescută indică o putere reducătoare mare.