Cultivarea bacteriilor lactice pe mai multe medii

1. Cultivarea bacteriilor lactice pe mai multe medii, studii privind unele bacterii lactice producatoare de compuşi volatili

Pe baza structurii lor primare, masă moleculară şi termostabilitate, bacteriocinele produse de bacteriile lactice se pot clasifica în patru clase importante (Klaenhammer, 1993) :

- bacteriocine mici (19-37 aminoacizi), termorezistente, care conţin în molecula lor resturi de lantionină (lantibiotice), de exemplu nisina, lacticina 481 şi lactocina S;

- bacteriocine care nu conţin lantionină (non-lantibiotice), mici (<15.000 Da), termorezistente, de exemplu diplococina, lactococina A, lactacinele B şi F, carnobacteriocinele etc.

- bacteriocine non-lantibiotice mari (>15.000 Da), termosensibile, de exemplu helveticina J, lacticinele A şi B etc.

- bacteriocine cu structură complexă, care prezintă pe lângă o parte proteică, un rest lipidic sau un carbohidrat, importante pentru manifestarea activităţii bactericide.

Sensibilitatea la acţiunea enzimelor proteolitice este un criteriu cheie în caracterizarea bacteriocinelor, având în vedere natura lor proteică. Activitatea antibacteriană este afectată de tripsină, a-chimotripsină, pepsină, proteinază K etc., sensibilitatea variind între bacteriocinele izolate de la specii diferite. Sensibilitatea bacteriocinelor la acţiunea unor enzime de origine pancreatică sau prezente în sucul gastric, prezintă importanţă în utilizarea bacteriocinelor drept conservanţi alimentari, deoarece asigură inactivarea lor înainte de a ajunge în intestin, prevenind o eventuală acţiune asupra microorganismelor care colonizează intestinul. Există şi bacteriocine a căror activitate nu este afectată de acţiunea enzimelor proteolitice, probabil datorită faptului că au în structura lor doar o mică porţiune de natură proteică, neesenţială în exercitarea activităţii. Aceste bacteriocine pot conţine în structura lor glucide, lipide sau fosfolipide, fiind sensibile la acţiunea enzimelor glicolitice, respectiv a lipazelor şi fosfolipazelor.

Proiectul de faţă şi-a propus selectarea unor noi bacterii lactice producătoare de bacteriocine şi studiul efectelor induse de acestea la nivelul celulelor sensibile (modificări de metabolism şi ultrastructurale), precum şi evaluarea modului în care prezenţa bacteriilor sensibile/rezistente afectează producerea de bacteriocine.

1.1. Izolarea unor noi tulpini de bacterii lactice

Ca sursă de izolare pentru tulpinile noi, au fost folosite: lapte şi produse lactate fermentate (iaurt, lapte bătut, smântână, brânză) colectate din diferite zone ale ţării, produse fabricate în mod tradiţional, în gospodării sau mici fabrici de prelucrare a laptelui. Porţiuni din aceste probe au fost dispersate în ser fiziologic peptonat (0.85 % NaCl + 0.1 % peptonă), făcute diluţii seriale şi însămânţate pe medii semiselective solide: mediul MRS (peptonă 10 g/l, extract de carne 10 g/l, glucoză 20 g/l, citrat de amoniu 2 g/l, acetat de Na 5 g/l, K2HPO4 2 g/l, MgSO4 0,1 g/l, MnSO4 0,05 g/l, Tween 80 1 ml/l, pH6.2, agar 15 g/l) şi mediul ST (triptonă 10 g/l, lactoză 10 g/l, agar 12 g/l, extract drojdie 5 g/l, KH2PO4 2 g/l, pH 6.8, agar 15 g/l). De pe plăcile care prezentau colonii izolate, bine diferenţiate, au fost prelevate cu ansa colonii care prezentau caracteristici diferite (formă, margini, culoare, dimensiuni etc.) şi însămânţate din nou, pe mediul solid identic cu cel de pe care s-au prelevat, în scopul purificării. Tulpinile purificate au fost cultivate apoi în mediu lichid şi depozitate la -75 °C, în prezenţa unui crioprotectant (glicerol 25%, v/v). Pentru identificare, tulpinile au fost supuse testului catalazei şi coloraţiei Gram. In plus, aceste tulpini au fost identificate pe baza unor criterii fenotipice şi prin tehnici moleculare moderne (electroforeza denaturantă a proteinelor totale, rep-PCR, secvenţializarea ARNr 16S), în cadrul unui laborator colaborator din Belgia (Universitatea din Ghent).

1.2. Selecţia de tulpini bacteriene producătoare de bacteriocine

Un număr de 185 de tulpini (în principal aparţinând genurilor Lactococcus, Leuconostoc şi Lactobacillus) au fost testate din punctul de vedere al producerii de bacteriocine. Ca tulpini indicator au fost folosite alte bacterii lactice, fie izolate din aceleaşi surse, fie tulpini existente deja în colecţia laboratorului nostru, dar şi bacterii potenţial patogene, cum ar fi: E. coli. Staphylococcus aureus, Salmonella panama şi Klebsiella pneumoniae. Ca metode de testare a efectului antibacterian au fost folosite metodele descrise de Gratia (1946) – Fig. 1a (coloniile de testat sunt acoperite cu un strat de mediu slab agarizat, conţinând şi tulpina indicator; după incubare, în jurul coloniilor apar zone clare de inhibiţie), Kekessy & Piguet (1970) – Fig. 1b (tulpinile testate sunt inoculate cu ansa pe medii solide, perpendicular pe tulpinile indicator; la zona de contact se observă lipsa creşterii tulpinii sensibile), Mayr-Harting şi colab. (1972) – Fig. 1c (culturile testate sunt centrifugate, iar supernatantul este depus la suprafaţa unui strat de mediu solid conţinând tulpina indicator; după incubare, în regiunile corespunzătoare spoturilor de supernatant apar zone clare de inhibiţie). Ultima dintre metode, numită şi “metoda spoturilor”, a fost folosită în continuare în experimentele noastre, fiind şi cea mai simplă şi rapidă.

Dintre cele 185 de tulpini testate, 24 au manifestat un efect antibacterian mai mult sau mai puţin evident faţă de tulpinile bacteriene folosite ca indicator. Majoritatea (20 de tulpini) au manifestat un efect antibacterian doar faţă de alte bacterii lactice. L. paracasei subsp. paracasei 46.6 a inhibat tulpina Klebsiella pneumoniae K33, în timp ce Leuconostoc mesenteroides 60.2, Lactococcus lactis subsp. lactis 100.4 şi Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus 104.4 au avut un efect inhibitor faţă de diverse tulpini aparţinând genurilor Bacillus, Propionibacterium şi Clostridium.

Fig. 1. Modalităţi de evidenţiere a producerii de bacteriocine de către bacteriile lactice

In unele dintre aceste cazuri, efectul inhibitor s-a datorat condiţiilor acide din mediu, create de creşterea bacteriilor testate, ca urmare a producerii acidului lactic. In aceste cazuri, neutralizarea supernatantului culturii, înainte de testare, a anulat efectul inhibitor faţă de tulpinile indicator. Doar 12 dintre cele 24 de tulpini selectate anterior şi-au menţinut efectul şi după neutralizarea valorii pH. In plus, în toate aceste cazuri, tratamentul cu o enzimă proteolitică (tripsină sau proteinază K) a anulat efectul inhibitor, dovedind natura proteică a compusului responsabil de acest efect (tabelul nr. 1). In concluzie, se poate spune că cele 12 tulpini produc compuşi antimicrobieni de tipul bacteriocinelor; patru dintre aceste tulpini (Leuconostoc mesenteroides 60.2, Lactococcus lactis subsp. lactis 100.1, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus 104.4 şi Lactobacillus acidophilus 418) au fost selectate pentru studiile ulterioare. Bacteriocinele izolate de la cele patru tulpini bacteriene menţionate, s-au dovedit a fi termorezistente, menţinându-şi activitatea inhibitoare şi după încălzirea lor la 100 °C timp de 30 minute.