Extras din laborator
OBtINEREA sI FUZIUNEA PROTOPLAsTILOR
Definitie:
Protoplastii sunt structuri celulare vegetale, sferice, izolate prin eliminarea enzimaticã a
peretelui celular pectocelulozic. În alcãtuirea unui protoplast se regãsesc: plasmalema,
citoplasma, nucleul, vacuola si organitele citoplasmatice – cloroplaste si mitocondrii.
Proprietãti ale protoplastilor:
- îsi pãstreazã potentialul de regenerare a peretelui celular
- îsi pãstreazã capacitatea de crestere si diviziune
- pot fi izolati dintr-o gamã largã de tesuturi si organe vegetale tinere
- pot fuziona
Obtinerea protoplastilor
Principiul metodei constã în disocierea celulelor si degradarea peretelui celular,
concomitent cu deshidratarea partialã a citoplasmei, protoplastii fiind recuperati prin centrifugare
si spãlare.
Peretele celular la plante este alcãtuit dintr-o membranã plasmaticã (plasmalema) si o
membranã scheleticã, ultima fiind alcãtuitã din celulozã si pectinã. La celulele izolate, peretele
celular reprezintã o barierã în circulatia substantelor, astfel cã acesta trebuie degradat, lucru
posibil pe cale mecanicã (centrifugare) sau pe cale enzimaticã (solutii cu pectinaze si
celulaze).
Etapele unei culturi de protoplasti:
1.Stabilirea surselor de material biologic, eventual sterilizarea lor
2. Pregãtirea materialului biologic pentru izolarea protoplastilor
3. Izolarea protoplastilor
4. Cultura de protoplasti
1. Stabilirea surselor de material biologic. Materialul biologic vegetal folosit pentru
izolarea protoplastilor poate fi reprezentat de: frunze tinere, apexuri, rãdãcini, fructe, coleoptile,
nodurile rãdãcinilor, tesuturi embrionare meristematice, cotiledoane, embrioni, microspori,
petale de flori, suspensii celulare embriogene.
Cele mai utilizate sunt: mezofilul foliar, culturile de calus sau de celule in vitro si
suspensiile celulare.
2. Pregãtirea materialului biologic. Cu exceptia suspensiilor celulare, materialul
biologic se sterilizeazã, se spalã si se scarificã cu scalpelul, apoi se introduce într-o solutie
hipertonicã (ex. metanol) pentru realizarea plasmolizei (pierderea apei pe principiul osmozei
duce la îndepãrtarea plasmalemei de peretele celular). Celulele plasmolizate capãtã aspect sferic,
peretii celulari pectocelulozici rãmânând intacti (Fig.1.,2.).
Fig.1. Celule de Elodea în timpul plasmolizei (Armstrong W.P., 2001)
2
Fig.2. Celule de Elodea înainte si dupã plasmoliza în solutie de NaCl 10%
(Armstrong W.P., 2001)
A. Peretele celular pectocelulozic
B. Protoplast (continut celular deshidratat partial, concentrat în centrul celulei)
C. Spatiul dintre protoplast si peretele celular
3. Izolarea protoplastilor se realizeazã cu ajutorul unor solutii enzimatice, la întuneric
si la cca. 25oC, care distrug peretii celulari (pectinaza determinã disocierea celulelor si celulaza
determinã degradarea peretelui celular). La speciile la care nu se pot izola protoplasti din
mezofilul foliar, se folosesc suspensii celulare embriogene rezultate prin cultivarea “in vitro” a
meristemelor apicale, cu sau fãrã celule “doicã” (celule din aceeasi specie sau alte specii,
introduse în mediul de culturã, care favorizeazã reconstituirea peretilor celulari). Solutiile cu
protoplasti se decanteazã si se filtreazã.
4. Cultura de protoplasti se realizeazã pe mediu lichid sau solid (Fig.3.), când se divid,
rezultând un microcalus din care se pot diferentia structuri embrionare globulare, respectiv
embrioni somatici (Fig.4., 5.). Prin transferarea embrionilor pe mediu agarizat, se pot dezvolta
plante identice cu plantele initiale. Prin aclimatizarea acestora si transferul în câmp, rezultã
culturi asemãnãtoare celor obtinute prin metodele traditionale de înmultire.
Fuziunea protoplastilor
Procesul de fuziune a protoplastilor constã în parcurgerea a 2 faze:
A. Contactul membranar în câmp de curent electric alternativ
B. Fuziunea în câmp de curent electric continuu (electrofuziune)
În mediul cu protoplasti se introduc electrozi sterilizati în prealabil, la bornele cãrora se
aplicã o tensiune alternativã de mare frecventã pentru alinierea protoplastilor, apoi socuri
electrice de curent continuu, pentru realizarea fuziunii acestora (Fig. 4.B.). Pot rezulta fuziuni
binare (câte 2) sau multifiziuni (mai mult de 2 protoplasti fuzionati), întreg procesul fiind urmãrit
la microscopul optic.
Preview document
Conținut arhivă zip
- Laboratoare Agronomie
- LP Ameliorarea plantelor industriale.pdf
- LP Embriogeneza somatica.pdf
- LP Micropropagarea culturi in vitro.pdf
- LP Obtinerea si fuziunea protoplastilor.pdf