Aplicațiile isotacoforezei capilare în determinarea peptidelor

Aplicatiile izotahoforezei capilare in determinarea peptidelor au fost studiate intens in ultimii ani. Tehnica a fost descoperita ca fiind o metoda foarte rapida si sensibila pentru a determina, de exemplu, puritatea peptidelor sintetice folosite in preparatele medicale. In cateva publicatii recente izotahoforeza capilara a fost demonstrate ca fiind o metoda excelenta in analiza calitativa si cantitativa a peptidelor din probe fiziologice cum ar fi urina si serul. Pentru a demonstra puterea de determinare a izotahoforezei in separarea proteinelor cu lant scurt, Everaets a folosit glutation, gly2, gly4 si Leu-Tyr ca si substante model. Miyazaki si Katoh au identificat conditiile de separare pentru 18 peptide diferite variind pH-ul electrolitului conducator. Astfel au fost determinate peptide hormonale cu importanta fiziologica cum ar fi bradikinina, kallidina, met-lys-bradikinina si glutationul redus si oxidat, ca si angiotensina I si II, oxitocina, arg-vasopresina, ACTH, somatostatina, VIP, secretina, colecistochinina.

Analiza peptidelor sintetice oxitocina si arg-vasopresina este ilustrata in fig 1.

Fig 1. Separarea peptidelor oxitocina si vasopresina sintetice. Probe: (A) Oxitocina 15 nmol (3 µl); (B) Arg-Vasopresina 15 nmol (3 µl); (C) 7 nmoli . Timpul de separare: 15 min. sistemul electrolytic nr. 44, pH1=7.0,

Puritatea fiecarui peptid a fost estimata in functie de raportul lungimii zonei peptidului fata de lungimea zonei de absorbtie UV si a fost stabilita ca fiind 90%. Desi cele 2 peptide au aceeasi structura de baza si este de prevazut ca au aceleasi mobilitati, ele pot fi separate destul de clar si distinctiv datorita absorbantei UV diferita (fig 1C).

Izotahoforeza capilara este ideala pentru monitorizarea schemei procesului de purificare al peptidelor. Este ilustrat in fig 2, in care peptidul cu actiune hormonala activa β-endorfina a fost analizat dupa 2 trepte diferite de purificare. Un alt exemplu al controlului izotahoforetic al procesului de purificare este dat de Kopwillen care a urmarit diferitele etape in sinteza tetradecapeptidului ciclic somatostatina. S-a demonstrate ca cel putin 90% din produsul final a fost hormonul dorit. Timpul analizei a fost 10 minute iar analiza a fost efectuata pe 20 µg material peptidic. O metoda asemanatoare a fost prezentata de Kopwillen pe un decapeptid sintetic si un undecapeptid obtinut cu sinteza Merrifield.

Fig. 2. Analiza peptidului β-endorfina dupa 2 trepte diferite de purificare. Sistemul electrolitic nr. 43, pH =4,2

Martin si Hampson au incercat sa analizeze insulina in amestecurile de electroliti metanol/apa, etanol/apa si 1-etoxietanol/apa, dar au raportat probleme in cea ce priveste reproductibilitatea, probabil datorita adsorbtiei la peretii capilarei. Baldesten a analizat recent izotahoforetic insuline monocomponente sau cu un singur varf, si a descoperit numeroase modele pentru insulina provenita din surse diferite. Cu tehnica si experimentele in 6M uree a fost demonstrat ca una din inconsistente s-a datorat probabil polimerizarii moleculelor de insulina. Mai multe analize ale insulinelor comerciale au dat modele diferite.

Fig. 3. Analiza peptidului gastrointestinal VIP in timpul procesului de purificare. Proba: 30 µg. Timpul de separare 10 min. Sistem electrolitic nr. 43, pH =5,1.